Els enzims a la indústria

 

1. La Biotransformació 

 

Es un procés mitjançant el qual un enzim específic (o un petit grup d'ells) catalitza una determinada reacció en unes condicions de treball determinades. Són processos emprats a escala industrial, en els quals no s´utilitzen microorganismes, sinó els enzims necessaris. Es, per tant, una aplicació de la biotecnologia a escala industrial.

La biotransformació presenta les següents avantatges:

-Els enzims poden catalitzar reaccions que no poden existir mitjançant química convencional.

-Poden facilitar ambdós sentits de la reacció: de reactiu a producte i de producte a reactiu.

-Si es troben immobilitzats per reïnes, els enzims poden catalitzar un procés continu i ser recuperats fàcilment del medi de reacció.

-Degut a la gran selectivitat dels enzims, podem partir de reactius racèmics i aconseguir un únic producte estereoquímicament pur.

-Obtenció d'elevats graus de conversió.

-Els processos catalitzats per compostos de coordinació requereixen escalfament, pH extrems i els efluents es troben contaminats amb metalls pesats; en canvi, les reaccions catalitzades per enzims requereixen condicions suaus de reacció (temperaturas properes a l'ambient, pH propers a la neutralitat) i els efluents no requereixen ser tractats.

Els inconvenients de la biotransformació:

-A nivel industrial, es requereix una quantitat d'enzim elevada i, per tant, té un elevat cost com a conseqüència dels processos de purificació requerits.

-Els enzims perden activitat al llarg del temps, com a conseqüència de processos d'inhibició, inactivació o pèrdua de la seva estabilitat.

-La presencia d'un isoenzim pot suposar l'aparició de reaccions laterals, obtenint una mescla de productes i, per tant, disminuint el rendiment de la reacció.

Com es porten a terme aquests processos tan específics? La resposta a aquesta qüestió té dues alternatives: La primera és addicionant al reactor un inòcul del microorganisme que és capaç de metabolitzar el reactiu, proporcionant el producte desitjat. Aquesta alternativa s´anomena FERMENTACIÓ, i requereix l´addició simultània de nudrients essencials, fonts de carboni i energia i altres requeriments del microorganisme utilitzat. La segona és addicionant al reactor una quantitat relativament petita de l´enzim que catalitza el procés. Aquesta alternativa s´anomena BIOTRANSFORMACIO i no requereix alimentar microorganismes, ni tenir un control acurat sobre el creixement d´aquest, essent per tant  una gran avantatge.

La biotransformació no empra els microorganismes, degut a les següents desavantatges:

-Els microorganismes requereixen un manteniment: una continua addició de fonts de carboni i energia, de nutrients essencials, d´un estricte   control del medi de creixement (pH, temperatura) i de la no aparició de cepes mutagèniques i contaminació biològica, que podrien dur a terme processos diferents.

-S`obtenen baixos rendiments, ja que la reacció d´interés  és un dels múltiples processos que tenen lloc als microorganismes;  inclús podria ser que el reactiu, el producte o un intermediari del procés fos tòxic pel microorganisme.

-El producte d´interés es troba en una matriu de nutrients i altres productes finals del metabolisme: es requereixen diferents tècniques de   separació per tal de recuperar el producte d´interés.

Els avantatges de la biotransformació, emprant només els enzims d´interés:

-El medi de reacció inicial només és el substrat del procés; aquest pot ésser una mescla racèmica, ja que l´enzim és capaç de distingir l´estereoisòmer correcte. En canvi, a la química convencional cal partir de l´estereoisòmer correcte  i pur, ja que qualsevol impuresa dóna lloc a reaccions laterals.

-S´obtenen  elevats rendiments, ja que l´enzim és molt selectiu i catalitza processos amb elevat grau de conversió. Per tant, només obtenim  un producte i no es requereixen separacions posteriors.

Els enzims amb major importància industrial són les hidrolases.

 

 

2. Elecció dels enzims

 

2.1. Enzims procedents d'organismes

Quan cerquem a la Natura enzims que ens puguin  ser d´utilitat a escala industrial, ens trobem amb una gran dificultat: sovint no presenten les característiques adequades; poden presentar inhibició per substrat o per producte, poden ser termolàbils, etc. I la biotecnologia industrial requereix que els enzims romanguin actius i estables durant molt temps, en solucions no aquoses, en condicions de pH, temperatura i força   iònica molt diferents als existents en el medi fisiològic, i incús que acceptin substrats sintètics.

 

2.2. Disseny d´enzims

Una solució a aquests problemes és produir nous enzims que satisfacin aquests requeriments, mitjançant l´alteració de la seqüència d´aminoàcids a nivell genètic. Per aquest fi, existeixen tres mètodes principals:

2.2.1. Mutagènesi aleatòria. Estratègia que imita l´evolució natural, però que té lloc en breus períodes de temps; per aquest motiu, s´anomena EVOLUCIO DIRIGIDA. No cal saber l´estructura exacta de l´enzim, fet que constitueix una gran avantatge i un gran estalvi  de temps. Consisteix en provocar mutacions en un gen, mitjançant la fragmentació aleatòria d´aquest i el seu posterior reensamblatge.   Distingim dues variants:

2.2.1.1. DNA-SHUFFLING: el procés s´inicia amb un únic tipus de gen, que codifica l´enzim que es preten modificar.

2.2.1.2. FAMILY-SHUFFLING: el procés s´inicia amb diferents gens de diferents espècies de microorganismes que codifiquen el mateix enzim. La recombinació de gens homòlegs genera una major varietat de mutants, i les seqüències són molt diferents.

Aquests gens alterats es clonen i immediatament  després són introduits en un microorganisme hoste per tal que siguin expressats. Els microorganismes hoste més usualment emprats són: Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae

Finalment, s´indentifiquen els microorganismes que expressen les propietats desitjades, s´aïllen i, si encara no estem satisfets, poden ser novament sotmesos al procés de mutació.

2.2.2. Mutagènesi dirigida o disseny racional. Mutagènesi en la qual podem substituir aminoàcids específics de la cadena polipeptídica, però es necesita conèixer a priori l´estructura exacta de l´enzim. Donat una seqüència monocatenària d´un gen clonat, s´uneix un oligonucleòtid sintètic  complementari portador de la mutació i que conté una base que no és complementària; a continuació se sintetitza la seqüència d´ADN i es tanca amb una ADN ligasa. El resulat són dues seqüències que es troben a tota la progènie.

2.2.3. Síntesi "de novo". El procés comença dissenyant oligonucleòtids  ue corresponen a l´expressió de quaranta a vuitanta aminoàcids,  i que units entre sí generen l´enzim complet. Un cop obtinguts els oligonucleòtics, s´escalfen a uns 80-90 ºC durant un breu període de temps, de pocs minuts, per tal de provocar la seva desnaturalització.  Seguidament, es deixen refredar a temperatura ambient i s´uneixen covalentment   per l´addició d´una ADN ligasa. El resultat són dues cadenes d´ADN, que han de ser purificades i unides a un gen que consitueix  el VECTOR EXPRESSIO, mitjançant una ADN ligasa.

 

 

3. Estabilització dels enzims als processos industrials

 

Per augmentar l´estabilitat dels enzims en un procés industrial, el mètode per excel.lència és  la seva immobilització en suports de diferent naturalesa. Aquesta immobilització implica una interacció amb un material polimèric, mitjançant  enllaç covalent, ponts d´hidrogen, interacció iònica, interaccions hidròfobes o forces de Van der Waals.

Els mètodes d´immobilització d´enzims per ús industrial:

 

3.1. Adsorció

Tècnica que aconsegueix concentrar fins 1 g d´enzim per gram de matriu. Es prepara incubant l´enzim i el material adsorbent en les condicions adequades, i netejant l´excés  de proteïna. Les interaccions que provoquen que l´enzim quedi a la superfície adsorbent són hidrofòbiques i/o iòniques. Els materials més àmpliament emprats són les reïnes de bescanvi iònic, el carbó porós, les reïnes polimèrique i la cerámica.

 

3.2. Acoblament covalent

Tècnica que aconsegueix una densitat d´enzims de 0.02 a 0.3 grams per gram de matriu. Atès que és la interacció més forta, evitem que es formi un enllaç enzim-superfície mitjançant l´addició del substrat abans de la interacció. Els materials més emprats són la cel.lulosa, els silicats, les terres diatomees i les partícules magnètiques.

 

3.3. Atrapament o retenció física

Els enzims queden atrapats als porus de fibres o de materials gelatinosos, arribant a una concentració de 1 gram d´enzim  per gram de matriu. Es ideal per processos que empren substrats de baixa massa molecular. El mètode més comú és  mesclant l´enzim amb alginat sòdic (un polisacàrid) i afegint  aquesta mescla sobre una dissolució de clorur càlcic. El resultat és un polisacàrid entrecreuat amb els enzims atrapats a la xarxa.