Recerca de Compostos d’Interès Farmacèutic Procedents de Microorganismes Marins (III). Aplicació Industrial
1. Bioprocessos marins en bioreactors
El creixent interès en la biotecnologia marina és deguda al seu potencial productor de nous productes naturals, conseqüència de l’elevada biodiversitat, i es centra en els metabòlits secundaris d’aplicació farmacèutica, essencialment nous microbicides per la seva creixent demanda [23].
1.1. Millora del bioprocés
Procediment emprat per augmentar el rendiment, usualment centrat en variar pressió, agitació i temperatura per influenciar la cinètica de reacció. El rendiment del bioprocés es pot controlar variant la composició del medi, millorant l’estratègia nutritiva, les condicions dinàmiques i físiques, immobilització i disseny de bioreactor [23].
La producció de metabòlits secundaris és un procés en dues fases; la primera, trofofase, correspon a la fase de creixement; la segona, idiofase, correspon a la fase de producció i usualment el creixement s’ha aturat o esdevé més lent. Per tant, el bioreactor és dissenyat per maximitzar la biomassa en un temps de trofofase mínim, assegurant les condicions òptimes per la producció a la idiofase [23].
1.2. Control de la síntesi d’antibiòtic via medi de nutrició
1.2.1. Font de Carboni
L’elecció de la font de carboni influencia en gran mesura al metabolisme secundari i, per tant, a la producció d’antibiòtics; per exemple, la glucosa sovint porta a un màxim creixement cel.lular, però inhibeix la producció de molts metabòlits secundaris. Aquesta repressió catabòlica podria ser deguda a alguns intermediaris generats al metabolisme de la glucosa que interfereixin als enzims del metabolisme secundari [23].
Les cèl.lules de creixement ràpid usualment presenten un metabolisme secundari inactivat fins que la velocitat de creixement esdevé més lenta, via inhibició feedback; aquest fet pot portar a una fermentació bifàsica, amb una producció únicament a la fase estacionària [23].
Es va trobar un Bacillus marí que només produïa un enzim d’interés en medi de nutrient diluït, suggerint ésser un oligòfil facultatiu [23].
La utilització de substrats alternatius, com la galactosa, ha millorat el rendiment de producció d’antibiòtic; per exemple, el rendiment de manamicina de Streptomyces augmenta quan al medi hi ha glicerol durant la fase de producció [23].
1.2.2. Font de nitrogen
La font de nitrogen també regula el metabolisme secundari. Elevades concentracions influencia la producció d’antibiòtics. Per exemple, l’amoni estimula al producció d’antibiòtics en Streptomyces griseofuocus. El control de la concentració d’amoni durant la meitat del cicle és essencial per l’optimització de la producció de metabòlits secundaris [23].
L’ús d’amino{cids no apropiats com a font de nitrogen pot inhibir la síntesi de metabòlits secundaris; contràriament, la utilització dels aminoàcids apropiats millora la producció d’antibiòtics. Per exemple, l’addició de cisteïna augmenta el rendiment d’{cid fenazina-1-carboxílic en Pseudomonas fluorescens, la metionina estimula la biosíntesi de cefalosporina C en Cephalosporium acremonium [23].
1.2.3. Fosfat
El fosfat és essencial pel creixement; no obstant, a determinades concentracions, pot inhibir el metabolisme secundari. El nivell d’ATP disminueix significativament abans de què comenci el metabolisme secundari, degut a l’activitat fosfatasa quan el creixement comença a aturar-se. El fosfat inorgànic reprimeix la síntesi de fosfatasa, permetent nivells elevats d’ATP que inhibeixen el metabolisme secundari. Per exemple, la limitació de fosfat estimula la producció de fistigimina en Streptomyces griseofuscus [23].
1.2.4. Elements traça
En el cas dels microorganismes marins, la concentració de bromurs pot ser significativa, sobretot en la producció d’antibiòtics halogenats. Altres ions afecten el rendiment; per exemple, el sulfat de zinc augmenta la producció de fenazina en Pseudomonas fluorescens [23].
1.3. Control de la síntesi d’antibiòtic via paràmetres físics
1.3.1. Temperatura
La temperatura afecta tant al creixement com a la fase de producció de metabòlits secundaris. Per exemple, Alteromonas marina creix millor a 28ºC però la producció del compost antiviral presenta un màxim a 25ºC [23].
1.3.2. pH
El pH del medi de creixement té un efecte directe en la producció de metabòlits secundaris. Un exemple és la producció de violacina pel bacteri marí Alteromonas leuteoviolacea, que s’inhibeix completament a pH=9 i és màxim a pH=7 [23].
1.3.3. Oxigenació
El grau d’oxigenació és crític per un òptim creixement en fermentacions aeròbiques. L’augment de la pressió parcial d’oxigen indueix la producció de nous metabòlits secundaris en Streptomyces parvulus; en canvi, la limitació en els nivells d’oxigen inicia el metabolisme secundari en Sacchoropolyspora erytherea i la presència d’oxigen redueix la producció de gramicidina en Bacillus brevis –que es soluciona desplaçant l’oxigen amb nitrogen a la idiofase- [23].
1.3.4. Salinitat
Molts bacteris marins presenten requeriments salins pel seu creixement –els halofílics, però no els halotolerants-. Per exemple, la salinitat afecta la producció d’aplasmomicina en Streptomyces marins. Les concentracions salines elevades causen problemes de corrosió al bioreactor i disminueix la dissolució de l’oxigen injectat al medi. [23].
1.3.5. Pressió
Els microorganismes són sensibles a les fluctuacions de pressió. Els bacteris associats a films superficials presenten una major barotolerància. Al reactor, l’efecte de la pressió pot augmentar la producció de metabòlits segons el principi de Le Chatelier [23].
1.4. Immobilització
La immobilització de cèl.lules viables és avantatjosa en determinats processos industrials. El mètode emprat depèn de les característiques cel.lulars. Un exemple és la producció d’antibiòtic de 12 soques de bacteris marins epibiòtics millorada després de la immobilització en una superfície polimèrica. La hidrofobicitat és un factor clau en la immobilització cel.lular; per exemple, els bacteris marins nitrificants prefereixen els substrats hidrofílics, essent més efectius els suports de polièster que de cel.lulosa [23].
Les principals avantatges de la immobilització cel.lular són: una major estabilització biològica, concentracions de biomassa elevades, transferència de massa optimitzada, augment de rendiment de producció, facilita el procés “downstream”, augmenta la selectivitat del procés i augmenta la versatilitat del disseny de bioreactor [23].
Els principals inconvenients són: la possibilitat de sobrecreixement cel.lular, trencament del suport i difusió limitada [23].
1.5. Disseny del bioreactor
Fins la data de l’article, els bioreactors més estudiats van ser els fotobioreactors marins. Molts bacteris marins es troben adaptats als seus hàbitats, afectant al seu comportament fisiològic com a simbionts, epibionts, baròfils, psicròfils, termòfils i oligòfils. Aquestes característiques han de ser implementades al disseny del bioreactor per assegurar l’efectivitat del procés.
S’han dissenyat 5 configuracions de bioreactor. El més comú és el tanc d’agitació (CSTR, Continuous Stirred Tank Reactor), que opera mesclant l’aire injectat el medi líquid amb un agitador i es troba embolcallat per una “jaqueta” pel control de la temperatura.
2. Estratègies
2.1. Bacterial milking
Mètode emprat per l’obtenció d’osmolits com, per exemple, ectoïna i hidroxiectoïna en Halomonas elongata.
Després d’una fermentació amb elevada densitat cel.lular de microorganismes halotolerants, es procedeix a un shock de salinitat, consistent en disminuir la salinitat del cultiu en un 10% o més. Per assolir de nou l’equilibri osmòtic, les cèl.lules alliberen al medi els osmolits (“milking”). Seguidament, la reincubació de les cèl.lules en un medi d’elevada salinitat durant un dia permet la regeneració dels osmolits per poder iniciar de nou el procediment d’extracció [1].
2.2. Flotació cel.lular
Das Sarma (1999) va patentar un vector recombinant capaç de dirigir la síntesi de vesícules de gas; els gens requerits procedeixen de l’Halobacterium halobium. Les cèl.lules transformants floten en el medi aquós, podent-se separar per una simple decantació [1].
2.3. Estabilització amb co-solvents
Donat un enzim procedent d’un microorganisme halòfil que requereix elevades concentracions de sal per assolir la seva activitat catalítica òptima, l’addició de solvents org{nics determinats, com la dimetilformamida, té un efecte positiu en l’estabilització dels enzims a baixes concentracions salines [1]. D’aquesta manera, es pot emprar l’enzim en condicions menys corrosives.
Bibliografia
[1] Margesin, R.; Schinner, F. “Potential of halotolerant and halophilic microorganisms for biotechnology”. Extremophiles (2001) 5: 73-83.
[2] Penesyan, A.; Kjelleberg, S.; Egan, S. “Development of Novel Drugs from Marine Surface Associated Microorganisms”. Mar.Drugs (2010) 8: 438-459.
[3] “Molecular Cloning. A Laboratory Manual”. Sambrook & Russell. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Third Edition (2001)
[4] Gervas, J. “La resistencia a los antibióticos: un problema de salud pública”. Atención Primaria (2000) 25:589-596.
[5] Pastor-S|nchez, R. “Alteraciones del nicho ecológico: resistencias bacterianas a los antibióticos”. (2006). Web: http://www.doyma.es
[6] Joerger, R.D. “Alternatives to antibiotics: bacteriocins, antimicrobial peptides and bacteriophages”. Poultry Science (2003) 82:640-647
[7] Fischetti, V.A. “Bacteriophage Lysins as Effective Antibacterials”. Curr Opin Microbiol (2008) 11(5):393-400
[8] Lane, A.L.; Moore, B.S. “A sea of biosynthesis: marine natural products meet the molecular age”. Nat Prod Rep (2011) 28:411-428
[9] AEMPS. Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios. “Cómo se regulan los Medicamentos y Productos Sanitarios en España”. (2010).
[10] Madigan, M.T.; Martinko, J.M.; Parker, J. “Brock Biología de los Microorganismos”. Pearson Prentice-Hall. Edició 10.
[11] Kim, J.; Park, E.J. “Cytotoxic Anticancer Candidates from Natural Resources”. Curr.Med.Chem (2002) 2:485-537
[12] Iizuka, T.; Fudou, R.; Jojima, Y.; Ogawa, S.; Yamanaka, S.; Inukai, Y.; Ojika, M. “Miuraenamides A and B, Novel Antimicrobial Cyclic Depsispeptides from a New Slightly Halophilic Myxobacterium: Taxonomy, Production and Biological Properties”. J Antibiot (2006). 59(7):385-91.
[13] Doshida, J.; Hasegawa, H.; Onuki, H.; Shimidzu, N. “Exophilin A, a New Antibiotic from a Marine Microorganism Exophiala pisciphila”. J Antibiot (1996) 49(11):1105-1109.
[14] Hugues, C.C.; Fenical, W. “Antibacterials from the Sea”. Chemistry (2010) 16(42):12512-25.
[15] Fudou, R.; Iizuka, T.; Yamanaka, S. “Haliangicin, a Novel Antifungal Metabolite Produced by Marine Myxobacterium”. J Antibiot (2001) 54(2):149-52.
[16] Bhatnagar, I.; Kim, S.K. “Immense Essence of Excellence: Marine Microbial Bioactive Compounds”. Mar Drugs (2010) 8: 2673-2701.
[17] Yasuhara-Bell, J.; Lu, Y. “Marine Compounds and their Antiviral Activities”. Antiviral Research (2010) 26:231-240.
[18] Nunnery, J.K.; Mevers, E.; Gerwick, W.H. “Biologically active secondary metabolites from marine cyanobacteria”. Curr Opin Biotechnol (2010) 21(6):787-93.
[19] Wijesekara, I.; Kim, S.K. “Angiotensin-I-Converting Enzyme (ACE) Inhibitors from Marine Resources: Prospects in the Pharmaceutical Industry”. Mar Drugs (2010) 8:1080-1093.
[20] Hill, R.T.; Fenical, W. “Pharmaceuticals from marine natural products: surge or ebb?”. Curr Opin Biotechnol (2010) 21(6):777-9.
[21] Iizuka, T.; Jojima, Y.; Fudou, R.; Yamanaka, S. “Isolation of Myxobacteria from the marine environment” . FEMS Microbiol Lett (1998) 169(2):317-22.
[22] Gilbert, J.A.; Laberock, B.; Temperton, B.; Thomas, S.; Muhling, M.; Hughes, M. “Metagenomics”. Methods Mol Biol (2011) 733:173-83.
[23] Marwick, J.D.; Wright, P.C. Burgess, J.G. “Bioprocess Intensification for Production of Novel Marine Bacterial Antibiotics Through Bioreactor Operation and Design”. Mar Biotechnol (1999) 1:495-507.
