Blue Biotech

Recerca de compostos d'interès farmacèutic procedents de microorganismes marins (I). Descripció biotecnològica.

 

Existeix una elevada biodiversitat de microorganismes als oceans, a la seva superfície, als sediments i associats a organismes pluricel.lulars que hi habiten. Aplicant les tècniques actuals de cultiu i aïllament, podem expandir el rang taxonòmic de microorganismes cultivables i descobrir nous compostos químics d’interès biotecnològic.

 

1. Els protagonistes: els microorganismes halotolerants i halofílics

 

Els microorganismes halotolerants i halofílics són extremòfils que viuen en ambients d’elevada salinitat. Els microorganismes halotolerants poden viure tant en presència com en absència de sal. En canvi, els microorganismes halofílics requereixen elevades concentracions salines per tal de poder créixer. Dins del grup dels halofílics, podem distingir tres grups: en primer lloc els microorganismes lleument halofílics, que requereixen aproximadament un 3% de clorur sòdic; en segon lloc, els halòfils moderats, que requereixen entre un 3 i un 15% de clorur sòdic; i, finalment, els halòfils extrems, que requereixen fins un 25% de clorur sòdic [1].

Les arquees halofíliques mantenen l’equilibri osmòtic respecte el seu entorn d’elevada salinitat acumulant elevades concentracions de sal; per tant, els seus enzims s’han adaptat per poder funcionar en ambients d’elevada força iònica. En canvi, els bacteris halofílics i halotolerants es caracteritzen per presentar una diversitat metabòlica molt superior; el seu citoplasma presenta una força iònica baixa, similar als bacteris terrestres, ja que regulen la pressió osmòtica acumulant soluts orgànics osmòtics al citoplasma i, per tant, els seus enzims intracel.lulars no toleren ambients d’elevada salinitat [1]. Aquesta característica és d’especial interès a la indústria, ja que aquests enzims podrien expressar-se en espècies no halòfiles/halotolerants.

 

2. Aplicacions biotecnològiques dels microorganismes marins

 

Els microorganismes halotolerants/halofílics i els seus compostos dels metabolismes primari i secundari s’empren o poden emprar-se en un ampli ventall d’aplicacions: biopolímers, memòries òptiques i altres compostos d’interès tecnològic, enzims, compostos i biomassa d’interès alimentari, bioremediació o inclús formes d’energia alternativa.

En el camp de la tecnologia destaca la bacteriorodopsina, una proteïna de membrana característica de l’arquea Halobacterium salinarum. Es troba en forma de plaques cristal.lines, de color púrpura y absorbeix eficientment al rang de 500 a 650 nm (llum verda). La conformació de la proteïna canvia quan absorbeix un fotó, podent actuar com a bomba de protons; l’entrada dels protons a favor de gradient es converteix en energia química. L’estabilitat termodinàmica i les propietats fotoquímiques i fotoelèctriques són de gran utilitat per aplicacions a nivell tecnològic, com holografia, moduladors lluminosos, retines artificials, memòries òptiques i material regrabable per informació òptica, entre altres. Es comercialitzat per les empreses COBEL (Barcelona) i MIB (Munnich Innovative Biomaterials, Alemanya) [1]. Recentment s’ha descrit la capacitat de fotoproducció d’hidrogen com a font alternativa d’energia de Rhodobium marinum, a partir de diòxid de carboni [1].

Les substàncies osmòtiques, com l’ectoïna, la trihalosa i el diglicerolfosfat, son substàncies de baix pes molecular, com sucres, alcohols i derivats aminoacídics, que mantenen la pressió osmòtica de microorganismes halotolerants i halofílics (p.e., Halomonas elongata, Archaeglobus fulgidus). Aquests compostos tenen aplicació com estabilitzadors d’enzims, ADN i membranes i confereix resistència a l’estrés salí i la temperatura [1].

Els biosurfactants, com la liquenisina (Bacillus licheniformis), són substàncies que disminueixen la tensió superficial, permetent la mobilitat de substàncies hidrofòbiques a la fase aquosa. La principal aplicació és la bioremediació de sòls i aigües contaminats amb hidrocarburs [1]. També hi participen en aquest tipus de bioremediació els exopolisacàrids, emprats com emulsificants. Són polímers d’elevada viscositat, inclús a baixes concentracions i elevades temperatures i amb elevada resistència a la degradació salina i tèrmica (Halobacterium salinarum, Haloferax volcanii, Halobacterium distributum) [1]. En el camp mediambiental, també hi destaquen els microorganismes que degraden pesticides persistents com el DDT i el lindà (Halobacterium sp., Haloferax sp.), compostos fenòlics (Halomonas sp.), compostos organohalogenats d’elevada toxicitat (Methilomicrobium sp.) els que mineralitzen hidrocarburs aromàtics policíclics PAHs (consorci patentat de bacteris halofílics) i els que disminueixen la demanda química d’oxigen (Halobacter halobium) [1].

Els liposomes són vesícules de membrana bicapa lipídica i amb nucli de solució aquosa, emprats en cosmètics i en el transport de fàrmacs fins llocs anatòmics específics. Els liposomes homogenis de l’Halobacterium cutirubrum es preparen per emulsió dels extractes de lípids amb èter, mitjançant l’extrussió a pressió a través de membranes de porus de mida determinada [1].

L’exopolímer PGA (àcid gamma-D-glutàmic) s’empra com a espessant, humectant i transportador de principis actius en fàrmacs, procedents d’arquees halofíliques extremes, com Natrialba [1].

Els polihidroxialcanoats (PHA) són compostos que s’acumulen en magatzems intracel.lulars en microorganismes marins com Haloferax mediterranei. Aquests polímers tenen aplicació en la fabricació de bioplàstics, quina biodegradabilitat és una gran avantatge mediambiental enfront els termoplàstics procedents d’hidrocarburs [1].

Existeixen enzims de microorganismes halofílics/halotolerants que són de gran interès industrial i científic, com la dihidropirimidasa (Pseudomonas sp.) emprada en la síntesi de D-aminoàcids (precursors de altres productes de interès industrial, com alguns antibiòtics), la β-galactosidasa (Haloferax alicantei) utilitzada en la fabricació de productes prebiòtics i la B-DNA topoisomerasa (Methanopyrus kandleri) que pot relaxar l’ADN superenrotllat positiva i negativament [1].

En el camp de l’alimentació, destaquen els aliments fermentats com la col àcida (Lactobacillus plantarum) i alguns productes orientals; els àcids grassos poliinsaturats de cadena llarga PUFA (Shewanella sp., Colwellia sp.) emprats com a suplements dietètics, juntament amb el β-Carotè, precursor de vitamina A (Haloferax alexandrinus) que també té aplicació com a colorant natural [1].

Finalment, en el camp dels productes fitosanitaris trobem compostos mol.lusquicides com la Barmamida (Lyngbia sp.) i nematicides com l’Onamida (simbiont de l’esponja Theonella swinhoei). Al camp dels productes farmacèutics trobem compostos microbicides (antibiòtics, antivirals, antifúngics, principalment) i altres fàrmacs d’interès actual, com els antitumorals (productes citotòxics), que analitzarem amb més detall.

 

3. Història

 

Des de l’elucidació de l’estructura del primer producte natural, els químics han quedat meravellats sobre la immensa varietat estructural dels metabòlits provinents dels organismes marins, eucariotes pluri i unicel.lulars i procariotes. Addicionalment, les seves activitats biomèdiques observades han dirigit l’interès en l’enteniment de les rutes bioquímiques en les quals aquests compostos hi formen part de la Natura [8].

No obstant això, els eucariotes han quedat a l’ombra dels procariotes, degut a la seva senzillesa genòmica, que ha permès la identificació i seqüenciació d’ADN. La biosíntesi en procariotes s’ha facilitat enormement per la seva organització gènica, típicament en clústers d’una única regió d’ADN de poques decenes o centenars de kb. Aquesta compartimentació dels gens ajuda a la seva identificació i als experiments en biologia molecular [8].

 

3.1. El clúster gènic de l’enterocina i la wailupemicina marca la primera seqüència d’ADN completada (2000). Les enterocines i les wailupemicines són productes d’activitat bactericida de Streptomyces maritimus, trobat a sediments marins, codificades per un clúster de 21 kb, interessants per la seva estructura carbonada amb anells aromàtics poc usual. L’anàlisi bioinformàtica va revelar que les proteïnes codificades eren homòlogues a la biosíntesi de policetides aromàtiques en microorganismes terrestres.

La maquinària biosintètica d’enterocina i wailupemicina inclou proteïnes ensamblades; posteriors estudis mutagènics van confirmar les funcions proteiques com a cetoreductasa, catàlisi oxidativa i reordenament d’enllaços carboni-carboni, condensacions aldòliques i formació d’heterocicles i centres quirals, alguns similars a la biosíntesi de benzoïl-CoA de les plantes terrestres [8].

 

3.2. Seqüenciació del genoma complet d’un microorganisme marí (2002). La millora en les tècniques de seqüenciació permet l’estudi de genomes complets. La seqüenciació del genoma complet avança l’enteniment del potencial metabòlic dels microorganismes marins.

Els actinomicets terrestres presenten l’habilitat de produir antibiòtics aplicables clínicament, essent essencialment del gènere Streptomyces. La seqüència gènica del primer actinomicet marí, Salinospora tropica, que inclou 17 clústers gènics, va revel.lar una extensa gamma biosintètica de productes naturals, que inclou la salinosporamida A, emprat com agent anticancerígen[8].

 

3.3. Seqüenciació gènica de cianobacteris marins (2003-). S’han seqüenciat des del 2003 el genoma complet de cianobacteris marins, podent estudiar clústers gènics per la biosíntesi de productes naturals de gran interès científic, com els metabolits secundaris de Lyngbya spp. Alguns exemples dels sus metabolits secundaris són la lingbiastatina (2003), un inhibidor de l’elastina emprat en el tractament de la fibrosi quística, la laxaficina A (2004), un agent antitumoral (citotòxic), curacina (2004), un antifúngic, i la barmamida (2003), una substància molusquicida [8].

La seqüenciació del genoma permet fer un estudi preliminar dels productes gènics –la seqüència de bases proporciona una seqüència aminoacídica-; emprant bases de dades proteiques –com Uniprot- es pot realitzar una inferència de la seva activitat biològica. Finalment, l’aïllament i la purificació de la proteïna permetrà un estudi més acurat de la seva estructura, i els assaigs pertinents confirmaran la seva activitat biològica [8].

 

3.4. Paper dels simbionts microbians a la biosíntesi de productes naturals d’origen marí (2008). La majoria dels microorganismes no són cultivables a condicions usuals del laboratori, esdevenent capacitats biosintètiques inaccessibles al llarg de la història.

Alguns productes naturals que inicialment s’aïllaven d’invertebrats marins, emprant mètodes clàssics de cultiu, immunolocalització, hibridació in situ i separació cel.lular. Posteriorment s’ha descobert que provenien de microorganismes simbionts, no dels seus hostes. Un exemple són els productes naturals obtinguts a partir d’esponges marines. La primera evidència d’aquest fet la va aportat Piel et.al. (2009), amb les onamides –nematicida- i les teopederines –agent antitumoral-, aïllades primerament de l’esponja Theonella swinhoei [8].

 

3.5. Elucidació de vies enzimàtiques (2009). L’halogenació va ser la primera via enzimàtica que van ajudar a entendre la biosíntesi de productes naturals en microorganismes marins. S’han aïllat uns 4500 compostos orgànics halogenats procedents d’organismes marins. L’halogenació és una via enzimàtica comú entre les algues. Un exemple és la biocloració que té lloc en la biosíntesi de salinosporamida A en S.tropica.

 

3.6. Manipulació de productes naturals (2010). Amb el coneixement de la seqüència de diversos clústers gènics i les vies biosintètiques associades, es va començar a dibuixar l’oportunitat de manipular els gens per obtenir proteïnes modificades. A mesura que la llibrerira gènica augmenta, la diversitat de possibles productes es magnifica [8].

 

3.8. Metagenòmica. La metagenòmica és l’estudi del material genètic extret directament de mostres ambientals. La microbiologia tradicional i la seqüenciació del genoma de microorganismes es basa en cultius clonals i, per tant, es limita als microorganismes cultivables. En canvi, la informació obtinguda mitjançant la seqüenciació de l’ADN ambiental (metagenoma) permet l’estudi de comunitats microbianes directament en el seu entorn natural, sense la necessitat d’aïllar i cultivar espècies al laboratori. Inicialment, es va seqüenciar gens específics, usualment ARNr 16S –degut a què és una seqüència curta i diferent entre espècies-, en mostres naturals, observant que apareixien seqüències d’espècies no aïllades i concluint que la majoria de la biodiversitat microbiana de les mostres es perdia als cultius. Actualment, la seqüenciació Sanger o la piroseqüenciació permeten estudiar tots els gens de tots els membres de la comunitat mostrejada. L’Expedició oceànica Global Ocean Sampling Expedition, dirigida per Craig Venter, va començar al 2003, recopilant mostres que s’han seqüenciat per identificar nous genomes i, per tant, nous microorganismes. El projecte pilot va iniciar-se al Mar Sargasso, trobant unes 2000 espècies noves, 148 de les quals eren bacteris. Al 2009, Venter havia circumnavegat el globus terraqui i explorat les zones costeres dels EEUU i els mars Bàltic, Mediterrani i Negre.

La metagenòmica ha obert una porta que ens permet gaudir de la font genètica dels microorganismes no cultivables, descobrint nous gens, enzims i productes naturals. L’impacte d’aquesta eina es centra en el desenvolupament de “fine chemicals”, fàrmacs i altres productes d’aplicació industrial.

La bioinformàtica ens permet manipular tota la informació obtinguda del metagenoma, podent interpretar els processos metabòlics que tenen lloc a les comunitats mostrejades, tant les interaccions entre microorganismes com les trobades entre simbionts/paràsits i els seus hostes.

 

4. Expectatives

 

L’estudi metagenòmic de les comunitats marines proporcionarà  la identificació de les espècies no cultivables, estimades en el 98%. Aquesta font d’informació permetrà ampliar exponencialment les bases de dades genòmiques, accedint així a un nombre astronòmic de nous compostos naturals i a un ampli ventall d’activitats enzimàtiques.

L’elevada biodiversitat marina magnifica l’ampliació de les bases de dades –genètiques i macromoleculars-. La bioinformàtica i la utilització d’organismes productors de compostos d’interès industrial substituiran, al llarg del temps, a la clàssica síntesi química.

 

 

 

5. Procediment de Recerca

 

Dels productes d’origen microbiològic, probablement els microbicides són els més importants tradicionalment, tot i que la comunitat mèdica està centrant el seu interès en els últims anys en altres fàrmacs de major impacte social, com els antitumorals (citotòxics).

Existeixen tres mètodes per la cerca de nous medicaments: el primer correspon a la modelització computacional; el segon consisteix en el rastreig o screening, on pot aïlla-se de la mostra un cultiu axènic, que es pot emprar directament (silvestre) o pot modificar-se genèticament (mutant); el tercer és l’aplicació de la metagenòmica per la cerca de noves espècies no cultivables. Finalment, la producció pot realitzar-se amb el microorganisme inicial o pot introduir-se el gen en un altre microorganisme mitjançant tècniques d’enginyeria genètica.

La modelització computacional consisteix en dissenyar molècules que interaccionin amb estructures determinades dels microorganismes diana; a més, aquests programes permeten assajar la seva toxicitat, disminuint el cost de la recerca. Un exemple és el desenvolupament del Saquinavir, un inhibidor de proteasa emprat per disminuir la velocitat de multiplicació del virus VIH [10].

El rastreig de microorganismes productors de nous fàrmacs és un mètode tradicional encara molt utilitzat; en aquest àmbit, la cerca de nous microorganismes en ambients encara no explorats, com els mars i oceans, esdevé una plataforma important per la cerca de nous compostos d’interés industrial.

El primer pas és l’obtenció d’un cultiu axènic. Els aïllaments candidats en la producció de nous fàrmacs s’estudien posteriorment per determinar si són fàrmacs nous; en el cas dels microbicides, la majoria corresponen a principis actius existents [10].

Quan s’aïlla un microorganisme que produeix un fàrmac nou, aquest es produeix en quantitats suficients per poder realitzar una anàlisi estructural i realitzar assaigs de toxicitat i activitat terapèutica [10]. Per millorar l’eficiència del fàrmac, es duu a terme a nivell gènic, mitjançant mutagènesi dirigida.

Un fàrmac que s’hagi de comercialitzar ha de ser obtingut amb èxit, prèviament, en bioreactors industrials; per tant, la primera dificultat és la purificació del producte; atès que la quantitat de producte al medi de fermentació és molt baixa, cal disposar de mètodes d’extracció i purificació –extracció amb solvents orgànics, columnes de bescanvi iònic, etc-. L’objectiu és l’obtenció d’un producte cristal.lí d’elevada puresa [10].

Respecte a l’eficàcia a nivell industrial, és d’especial interès, en primer lloc, l’augment de la seva eficiència. Per optimitzar les condicions de cultiu, pot expressar-se aquests gens d’interès en un altre microorganisme, mitjançant la tecnologia d’ADN recombinant. D’aquesta manera, el gen que codifica el fàrmac en un microorganisme extremòfil –com els halofílics- es pot expressar en un organisme cultivable en condicions més econòmiques. En segon lloc, la tècnica d’amplificació gènica permet la inserció de còpies addicionals del gen d’interès –que codifica el fàrmac- mitjançant la inserció de vectors, com els plàsmids [10], podent així obtenir major quantitat de producte sense augmentar la massa cel.lular.

La metagenòmica és l’estudi del material genètic extret directament de mostres ambientals. La microbiologia tradicional i la seqüenciació del genoma de microorganismes es basa en cultius clonals i, per tant, es limita als microorganismes cultivables. En canvi, la informació obtinguda mitjançant la seqüenciació de l’ADN ambiental permet l’estudi de comunitats microbianes directament en el seu entorn natural, sense la necessitat d’aïllar i cultivar espècies al laboratori.  

 

Bibliografía i recursos web

[1] Margesin, R.; Schinner, F. “Potential of halotolerant and halophilic microorganisms for biotechnology”. Extremophiles (2001) 5: 73-83.

[2] Penesyan, A.; Kjelleberg, S.; Egan, S. “Development of Novel Drugs from Marine Surface Associated Microorganisms”. Mar.Drugs (2010) 8: 438-459.

[3] “Molecular Cloning. A Laboratory Manual”. Sambrook & Russell. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Third Edition (2001)

[4] Gervas, J. “La resistencia a los antibióticos: un problema de salud pública”. Atención Primaria (2000) 25:589-596.

[5] Pastor-S|nchez, R. “Alteraciones del nicho ecológico: resistencias bacterianas a los antibióticos”. (2006). Web: http://www.doyma.es

[6] Joerger, R.D. “Alternatives to antibiotics: bacteriocins, antimicrobial peptides and bacteriophages”. Poultry Science (2003) 82:640-647

[7] Fischetti, V.A. “Bacteriophage Lysins as Effective Antibacterials”. Curr Opin Microbiol (2008) 11(5):393-400

[8] Lane, A.L.; Moore, B.S. “A sea of biosynthesis: marine natural products meet the molecular age”. Nat Prod Rep (2011) 28:411-428

[9] AEMPS. Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios. “Cómo se regulan los Medicamentos y Productos Sanitarios en España”. (2010).

[10] Madigan, M.T.; Martinko, J.M.; Parker, J. “Brock Biología de los Microorganismos”. Pearson Prentice-Hall. Edició 10.

[11] Kim, J.; Park, E.J. “Cytotoxic Anticancer Candidates from Natural Resources”. Curr.Med.Chem (2002) 2:485-537

[12] Iizuka, T.; Fudou, R.; Jojima, Y.; Ogawa, S.; Yamanaka, S.; Inukai, Y.; Ojika, M. “Miuraenamides A and B, Novel Antimicrobial Cyclic Depsispeptides from a New Slightly Halophilic Myxobacterium: Taxonomy, Production and Biological Properties”. J Antibiot (2006). 59(7):385-91.

[13] Doshida, J.; Hasegawa, H.; Onuki, H.; Shimidzu, N. “Exophilin A, a New Antibiotic from a Marine Microorganism Exophiala pisciphila”. J Antibiot (1996) 49(11):1105-1109.

[14] Hugues, C.C.; Fenical, W. “Antibacterials from the Sea”. Chemistry (2010) 16(42):12512-25.

[15] Fudou, R.; Iizuka, T.; Yamanaka, S. “Haliangicin, a Novel Antifungal Metabolite Produced by Marine Myxobacterium”. J Antibiot (2001) 54(2):149-52.

[16] Bhatnagar, I.; Kim, S.K. “Immense Essence of Excellence: Marine Microbial Bioactive Compounds”. Mar Drugs (2010) 8: 2673-2701.

[17] Yasuhara-Bell, J.; Lu, Y. “Marine Compounds and their Antiviral Activities”. Antiviral Research (2010) 26:231-240.

[18] Nunnery, J.K.; Mevers, E.; Gerwick, W.H. “Biologically active secondary metabolites from marine cyanobacteria”. Curr Opin Biotechnol (2010) 21(6):787-93.

[19] Wijesekara, I.; Kim, S.K. “Angiotensin-I-Converting Enzyme (ACE) Inhibitors from Marine Resources: Prospects in the Pharmaceutical Industry”. Mar Drugs (2010) 8:1080-1093.

[20] Hill, R.T.; Fenical, W. “Pharmaceuticals from marine natural products: surge or ebb?”. Curr Opin Biotechnol (2010) 21(6):777-9.

[21] Iizuka, T.; Jojima, Y.; Fudou, R.; Yamanaka, S. “Isolation of Myxobacteria from the marine environment” . FEMS Microbiol Lett (1998) 169(2):317-22.

[22] Gilbert, J.A.; Laberock, B.; Temperton, B.; Thomas, S.; Muhling, M.; Hughes, M. “Metagenomics”. Methods Mol Biol (2011) 733:173-83.

[23] Marwick, J.D.; Wright, P.C. Burgess, J.G. “Bioprocess Intensification for Production of Novel Marine Bacterial Antibiotics Through Bioreactor Operation and Design”. Mar Biotechnol (1999) 1:495-507.

-Pacific Research Center for Marine Biomedicine: http://www.prcmb.hawaii.edu/

-Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios (AEMPS): http://www.aemps.es/actividad/nosotros/home.htm

-Ministeri de Sanitat, Política Social i Igualtat: http://www.msps.es/